Protein-Protein-Interaktion sind für das Verständnis von biologischen Prozessen auf molekulare Ebene von elementarer Bedeutung.

In diesem Kurs werden wir Protein-Protein-Interaktion sowohl in silico als auch in vitro untersuchen. Basierend auf unseren Erkenntnissen aus der strukturellen Analyse werden wir versuchen Experimente zu entwickeln diese Erkenntnisse zu untersuchen.

Das Modul besteht aus 4 praktischen Wochen.

In diesem Kurs werden wir biochemisch im Labor und zum (kleineren) Teil strukturanlytisch am Computer arbeiten.

Neben genereller Arbeit in einem S1-Labor werden wir insbesonder diese Techniken erlernen bzw. anweden:

• Ortsspezifische Mutagenese & Sequenzierung & DNA-Isolation
• Rekombinante Proteinexpression und -reinigung
• Analyse von Proteinstrukturen und deren Interpretation
• Bestimmung der Bindungsaffinität (K_D) mittels ELISA-ähnlichen Bindungsmethoden
• Bestimmung der Reaktionsgeschwindigkeitskonstanten und kinetische Analyse einer Bindung mit Bio‑Layer‑Interferometrie
• Bestimmung des Schmelzpunktes von Proteinen mittels circular dichroism
• Bestimmung der optimalen Lagerpuffer & Thermostabilität mittels Differential Scanning Fluorimetry
• Eukaryotische Zellkultur / in vitro wound healing assays

Einige werden weiter unten detailierter beschrieben.

Mittels eine ELISA-ähnlichen Bindungsassay lassen sich schnell und zuverlässig Bindungen von Protein überprüfen. Diese Assayform ist besonder gut geeinget verschieden Bindungspartner in relativ schneller Folge zu untersuchen. Er benötigt zusätzlich nur wenig experimentelle Gerätschaften und ist somit breit einsetzbar.

Mittels Modifikationen ist der ELISA Assays auch in der Lage Bindungsinhibitoren oder Proteinkonzentrationen in z.b. biologischen Proben zu bestimmen.

https://de.wikipedia.org/wiki/Enzyme-linked_Immunosorbent_Assay

In der Bio-layer interferometry (BLItz) kann eine zeitliche Auflösung des Binde- (k_on)und Ablösevorganges (k_off) gemessen werden. Dies vermitteln einen besseren Eindruck vom eigentlich physikalischen Vorgang der Bindung und ermöglicht die Unterscheideung von "schnellen" und "langsamen" Bindern. Während die Technik mit der entrsprechenden technischen Ausstattung und Automation auch relative viele Proben verarbeiten können, werden wir uns im Praktikum auf einzelne Messungen beschränken müssen. 

https://de.wikipedia.org/wiki/Bio-Layer-Interferometrie

Die Überprüfung von Theorie zu Protein-Protein-Bindungsstellen werden regelmäßig ortspezifische Mutagenesen durchgeführt. In diesem Kurs werden wir die gängiste Mutagenese-Methode nach dem "Quikchange(TM)"-Protokoll durchführen. Mit etwa experimentellem Glück, werden wir diese selbst-entworfenen mutierten Proteine in unseren Bindungsstudien testen können.

https://en.wikipedia.org/wiki/Site-directed_mutagenesis#Whole_plasmid_mutagenesis

Die Struktur eines Proteins definiert sein Funktion und die Strukturuntersuchung von Protein-Komplexen ist grundlegend für das Verständniss von biologischen Vorgängen. Wir werden den Umgang mit Strukturen und Strukturkomplexen lernen und versuchen zu verstehen was einen Proteinkomplex zusammenhält. Idealerweise können wir darauf Hypothesen erstellen die wir mittels eines Mutageneseexperiments untersuchen.

Zellkulturtechniken sind ein wichtiger Bestandteil der Biochemie. Ob "lediglich" zur Produktion von Protein, zur Analyse zellbiologische Vorgänge oder Simulation ganzer Organe ist das Arbeit unter sterilen Bedingungen mit eukaryotischer Zellkultur von großer Bedeutung.

Wir werden in der Zellkultur transient eukaryontische Protein exprimieren und mittels Pull-Down nachweisen. Unsere Transfektionseffizenz werden wir mittel Fluoreszenzmikroskopie kontrollieren. Dabei werden wir grundlegende Techniken in der Zellkultur (steriles Arbeiten, Zellen zählen, Zellen passagieren) kennenlernen.